Blog del Medio Ambiente: ENUMERACION BACTERIANA: O NUMERO MAIS PROBABLE

O METODO DE NUMERO MAIS PROBABLE (NMP)
E unha estratexia efeciente de estimación de densidades poblacionales especialmente cando unha avaliación cuantitativa de células individuais non é factible. A técnica baséase na determinación
de presenza ou ausencia (pos ou neg) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en mostras de chan ou outros ambientes. Polo tanto,
un requisito importante deste método é a necesidade de poder recoñecer un atributo particular da poboación(é) no medio de crecemento a utilizarse. O estimado de densidad poblacional obtense do patrón de ocorrencia dese atributo en diluciones seriadas e o uso dunha táboa probabililística.

Algunhas das vantaxes do NMP son:

A capacidade de estimar tamaños poblacionales baseados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por exemplo pódese determinar a densidad poblacional de organismos que poden nodular leguminosas nunha mostra de chan usando o método de infección de plantas, (ii) prové unha recuperación uniforme das poboacións microbianas de chans diversificados, (iii) determina só organismos vivos e activos metabólicamente, e (iv) adoita ser máis rápido e igual de confiable que os métodos tradicionais de esparcimiento en pratos de cultivo, entre outros.
Neste exercicio, utilizarase unha variante desta metodología para estimar a densidad total de bacterias presentes nunha mostra. O atributo particular a utilizarse será a capacidade de microorganismos a formar colonias en medios sólidos de crecemento.

Materiais e Equipos:

Mostras ambientais (lodos activados, ríos, charcas, chan, etc.)
Placas Petri con medio de crecemento (R2A, LB, TSA ou outro)
Tubos de dilución con 9 ml de 0.85% NaCl
Micropipetas de 20 micro ml
Puntas para micropipeta
Incubadora a 25°C
Vortex

METODOLOGIA

1. Mostras: Colecte asépticamente mostras frescas de chan (10 g) de varios
lugares ou obteña mostras de auga (10 ml) de lagos, ríos ou charcas.
2. Extracción de microorganismos viables: Para mostras de chan, as células poderán
ser removidas e homgenizadas engadindo 1 g de mostra a un tubo de ensaio que
conteña 9 ml de solución salina. Axite moderadamente por 5 minutos nun vortex.
3. Diluciones en serie: O extracto de chan pode ser diluído seriadamente transfiriendo
1 ml a un tubo con 9 ml de 0.85% NaCl. Cada transferencia corresponde a unha
dilución de 1 en 10. Repita en serie o procedemento de dilución ata alcanzar a
dilución 10-7. Para mostras líquidas, mesture ben a mostra e proceda a preparar
as diluciones seriadas como foron descritas anteriormente.
4. Placas Petri: Utilizando un marcador, divida a placa petri en cinco zonas de igual
tamaño. Use unha placa por cada mostra. Rotule cada zona co factor de dilución
a ser inaculado.
5. Inoculación: Transfiera 5 micro ml da dilución apropiada ao área correspondente. Repita
esta operación cinco veces por cada dilución.
6. Permita que o incóculo seque sobre o medio de crecemento. Selle a placa cun
tirillade parafina. Invista a placa e incube a 25°C por 7 días.
7. Avaliación de crecemento: Para cada dilución en asendencia evalue o crecemento ou
non crecemento sobre cada réplica incoculada. Reporte os resultados como se indican
no exemplo a continuación.

Datos e Análises:

Utilizando os valores ofrecidos na táboa 1 (taboa que anteriormente buscaremos en libros , paxinas web...), determine a poboación estimada para a súa mostra (ej., 5-5-3-2-0: 1,383). Do seu patrón de respostas non estar na táboa, promedie o valor estimado do patrón superior e inferior presente na táboa 1 (ej., 5-4-1-1-0 non está na táboa, entón promedie 5-4-1-0-0 (169) e 5-4-2-0-0 (216) como o resultado máis apropiado: 5-4-1-1-0 = (169 216)/2 = 193). Este valor obtido é o NMP sen axustar.
Para calcular a densidad poblacional da mostra, entón terá que multiplicar o NMP sen axustar polo factor de correción de volume (ver nota Táboa 1) polo recíproco do factor de dilución menor inoculado na placa (ej., 5-5-3-2-0: 1,383 X 200 X 1000 = 2.78 x 108 células/g de chan).